電泳凝膠回收的心得體會
電泳凝膠回收的心得體會 | 時間: September-29 11:05:20 | 分類:技術欄目
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1. 提高膠回收量的辦法：
1) 增加電泳時的上樣量。
2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。
3) 切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。
4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉移到同一個柱子上。
5) 溶膠時所加的溶液可多一點，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過一般不要多余750ul。
6) 膠回收的關鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。
7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。
8) 較后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。
10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。
2. 幾種PCR 產物回收的詳方法和步驟
1) 普通膠回收
如果要膠回收，較好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。
2) 從低熔點凝膠回收DNA
純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置
3) 擴增特異性好的PCR回收
如果PCR擴增特異性好，只是簡單的PCR產物純化回收，可以在PCR產物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。
3. 不需膠回收就可直接連接的方法
1) 低溫冷凍析出法
跑電泳時用低熔點的agarose膠，跑到一定時候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個管子中，做好標記，放在－20度備用。
2) 酶切后的直接連接
在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進行連接是可以篩選出連接好的片斷的
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1.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。
2.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標記的探針用X片，未標記的用EB。
3.選用回收效率較高的柱子，比如進口的Qiaquick spin column。
4.參照分子克隆用低熔點膠回收。除低熔點凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。
