蛋白質(zhì)沉淀法
蛋白質(zhì)沉淀法 | 時(shí)間: October-18 12:24:35 | 分類:技術(shù)欄目
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1．鹽析法 多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。
2．有機(jī)溶劑沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。
3．等電點(diǎn)沉淀法 用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它兩性物質(zhì)的沉淀。但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。
4．非離子多聚體沉淀法 用于分離生物大分子。
5．生成鹽復(fù)合物沉淀 用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。
6．熱變性及酸堿變性沉淀法 用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。
第一節(jié) 鹽析法
一般來說，所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程叫鹽析。在生化制備中,許多物質(zhì)都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質(zhì)沉淀較為常見，特別是在粗提階段。
鹽析法分為兩類，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn)，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。
一．影響鹽析的若干因素
1．蛋白質(zhì)濃度
高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質(zhì)的b 和Ks常數(shù)十分接近，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用；在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。用于分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至較低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。
2．離子強(qiáng)度和類型
一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來后，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。
離子種類對蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。
3．PH值
一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度較小。為提高鹽析效率，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液PH值，以達(dá)到較好的鹽析效果。
4．溫度
在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0
二．硫酸銨的使用
硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，
硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測量飽和度，故多用于結(jié)晶，其它情況少見。
使用固體硫酸銨時(shí)：1）必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有
第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法
有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，較后析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；3）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點(diǎn)是對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來說，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。
有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
有多種因素影響有機(jī)溶劑的沉淀效果：1）溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低其溶解度，提高提取效率；2）樣品濃度和PH 與鹽析法中的作用基本相同；3）金屬離子一些多價(jià)陽離子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性。4）離子強(qiáng)度 鹽濃度太大或太低都對分離有不利影響，對蛋白質(zhì)和多糖而言鹽濃度不超過5%比較合適，使用的乙醇量不超過二倍體積為宜。
第三節(jié) 其他沉淀法
一．等電點(diǎn)沉淀法
兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度較低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。
利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。 不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整PH值。 等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。
二．生成鹽復(fù)合物沉淀法
1．金屬復(fù)合鹽法
許多有機(jī)物質(zhì)包括蛋白在內(nèi)，在堿性溶液中帶負(fù)電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據(jù)有機(jī)物與它們之間的作用機(jī)制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類，如銅鋅鎘；親羧酸疏含氮化合物類，如概鎂鉛；親硫氫基化合物類，如汞銀鉛。蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物的重要性質(zhì)是它們的溶解度對溶液的介電常數(shù)非常敏感，調(diào)整水溶液的介電常數(shù)（如加入有機(jī)溶劑），即可沉淀多種蛋白。
2． 有機(jī)鹽法
含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)，故用于制備蛋白質(zhì)時(shí)，需采用較溫和的條件，有時(shí)還需加入一定的穩(wěn)定劑。
3．無機(jī)復(fù)合鹽法
如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。
以上鹽類復(fù)合物都具有很低的溶解度，極易沉淀析出。若沉淀為金屬復(fù)合鹽，可通以H2S使金屬變成硫化物而除去，若為有機(jī)酸鹽或磷鎢酸鹽，則加入無機(jī)酸并用乙醚萃取，把有機(jī)酸和磷鎢酸等移入乙醚中除去，或用離子交換法除去。值得注意的是此類方法常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。
三． 選擇性變性沉淀
其原理是利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。
此方法可分為：1）利用表面活性劑(三氯乙酸)或有機(jī)溶劑引起變性；2）利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；3）酸堿變性。
四．非離子多聚物沉淀法
非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，較早用于提純免疫球蛋白、沉淀一些細(xì)菌和病毒，近年來逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離提純。這類非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等，其中應(yīng)用較多的是聚乙二醇。
用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有兩種方法：1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。此方法基于不同生物分子表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)。并外加離子強(qiáng)度、PH值和溫度等影響，從而擴(kuò)大分離效果。2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。該方法操作時(shí)先離心除去大懸浮顆粒，調(diào)整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時(shí)間，即形成沉淀。
