電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因及動(dòng)物克隆中的應(yīng)用
電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)基因及動(dòng)物克隆中的應(yīng)用 | 時(shí)間: September-15 12:41:51 | 分類(lèi):技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機(jī)，美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)電泳，德國(guó)eppendorf艾本德移液器，美國(guó)ABI基因擴(kuò)增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛(ài)思進(jìn)，Greiner格瑞拉等耗材要省錢(qián)，別錯(cuò)過(guò)哦。Application of Electroporation in Gene Transfer and Animal Embryo Cloning
郝新保 范清宇 Hao Xin-bao Fan Qing-yu
第四軍醫(yī)大學(xué)全軍骨腫瘤研究所 西安 710038
Institute of Orthopedic Oncology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, China 摘 要 電穿孔技術(shù)利用電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的改變從而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)還可用于細(xì)胞融合以及動(dòng)物克隆等。基因電轉(zhuǎn)移的效率通常比化學(xué)法提高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，主要與脈沖波形、長(zhǎng)度、緩沖液等有關(guān)。方波直流電脈沖應(yīng)用廣泛，在有關(guān)細(xì)胞核移植的多項(xiàng)研究報(bào)告中均指出其重要作用。關(guān)鍵詞 基因轉(zhuǎn)移，胚胎克隆，電穿孔
過(guò)去十年中，關(guān)于基因功能的研究取得了豐碩的成果，并因此帶動(dòng)了基因工程、基因治療以及單克隆抗體技術(shù)的進(jìn)步，而在動(dòng)物生殖生物學(xué)領(lǐng)域的革命性技術(shù)進(jìn)步則導(dǎo)致了綿羊、牛、猴子和小鼠等多種動(dòng)物的克隆成功。電穿孔技術(shù)和儀器的發(fā)展在這些成就中扮演了重要角色，使得人類(lèi)不但能從胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物，甚至能從完全分化的成熟細(xì)胞獲得克隆動(dòng)物。全新的基因操作和生殖技術(shù)將為21世紀(jì)帶來(lái)重要的科學(xué)成就。電穿孔技術(shù)是利用脈沖電場(chǎng)改變細(xì)胞膜的狀態(tài)和通透性，達(dá)到將DNA導(dǎo)入細(xì)胞以及促使細(xì)胞發(fā)生融合的目的。該技術(shù)目前一方面應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應(yīng)用于細(xì)胞融合制備雜交細(xì)胞和動(dòng)物克隆等。
1、 在基因轉(zhuǎn)移和雜交瘤中的應(yīng)用
1.1 動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染電穿孔技術(shù)在80年代初期開(kāi)始用來(lái)將DNA導(dǎo)入多種動(dòng)物細(xì)胞[1]，較之傳統(tǒng)的磷酸鈣和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)那些其它方法難以奏效的細(xì)胞具有明顯優(yōu)勢(shì)，但它的影響因素也比較多。電場(chǎng)強(qiáng)度：電壓太低時(shí)，細(xì)胞膜的改變不足以允許DNA分子通過(guò)，而電壓過(guò)高時(shí)又會(huì)造成細(xì)胞的不可逆損害。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞而言，250-2500V/cm的電壓可獲得有效轉(zhuǎn)染[2,3]。電脈沖形狀和長(zhǎng)度：電脈沖形狀主要有指數(shù)衰減式和方波兩種，大多歷時(shí)20-100毫秒。緩沖液：通常使用甘露醇和蔗糖等非離子緩沖液，但有報(bào)道認(rèn)為HEPES緩沖液的轉(zhuǎn)染效率更高，血清也可以提高轉(zhuǎn)染效率[4]。其它諸如轉(zhuǎn)染溫度，DNA濃度和構(gòu)象等均會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響。
1.2 大腸桿菌和酵母的轉(zhuǎn)化電穿孔法在80年代末開(kāi)始被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌[5]，由于細(xì)菌相對(duì)較小，因此與DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞相比，大腸桿菌通常要求4000-20000V/cm的脈沖強(qiáng)度才能獲得有效轉(zhuǎn)染?；瘜W(xué)法感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高只能達(dá)到每微克DNA 106-108個(gè)轉(zhuǎn)化體，而電穿孔法卻可以達(dá)到109-1010個(gè)轉(zhuǎn)化體的水平，較前者提高10-100倍，因此在制備cDNA文庫(kù)等要求較高轉(zhuǎn)化率的工作中就顯得十分關(guān)鍵。 酵母菌電轉(zhuǎn)化克服了乙酸鋰和原生質(zhì)體法煩瑣和轉(zhuǎn)化率低的不足，效率明顯提高[6]。
1.3 細(xì)胞融合制備雜交瘤 細(xì)胞融合主要用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞[7,8]。在單克隆抗體的制備過(guò)程中，傳統(tǒng)用PEG融合法產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，這在現(xiàn)代化生產(chǎn)中存在許多局限性。而電融合法制備雜交瘤可以大規(guī)模地批量、高效融合，縮短了整個(gè)生產(chǎn)周期。除此以外，在細(xì)胞生物學(xué)研究中電融合還被廣泛應(yīng)用于其它雜交細(xì)胞的制備[9]。
2、胚胎工程的核移植和活化 在從簡(jiǎn)單的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染到核移植胚胎的電活化中，電穿孔技術(shù)都發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，下面是一些重要的應(yīng)用。
2.1 單性生殖、四倍體及嵌合體
2.2 電融合在核移植技術(shù)中的應(yīng)用
1938年當(dāng)Hans Spemann提出核移植的設(shè)想時(shí)克隆技術(shù)已經(jīng)初露端倪。首次在兩棲類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行的克隆報(bào)道于1952年，但直到1970年青蛙才被克隆成功。核移植是目前多個(gè)物種生殖研究的熱點(diǎn)技術(shù)。 核移植克隆的目的是將被克隆生物的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到宿主系統(tǒng)中來(lái)指導(dǎo)胚胎的發(fā)育并產(chǎn)下新的個(gè)體。首先將針插入去核卵母細(xì)胞的透明帶，把供體細(xì)胞注入卵母細(xì)胞的卵黃周間隙。細(xì)胞融合儀提供的交流電使供體細(xì)胞和卵母細(xì)胞排列好，隨后1到數(shù)個(gè)直流波使核移植胚胎被激活而發(fā)生分裂。分裂產(chǎn)生的胚胎細(xì)胞被移植到代理母親子宮妊娠直到生產(chǎn)。
3、供核來(lái)源不同的核移植
3.1 以胚胎為基礎(chǔ)的核移植 由核移植產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物胚胎克隆涉及8-64個(gè)細(xì)胞胚胎的其中一個(gè)細(xì)胞與去核的成熟卵母細(xì)胞之間的融合。Ilmense 和Hoppe于1981年首次報(bào)道了產(chǎn)生成活個(gè)體的核移植[15]。他們的研究沒(méi)有被重復(fù)出來(lái)，但卻產(chǎn)生了效率更高的核移植技術(shù)[16]。許多物種成功的核移植實(shí)驗(yàn)都使用了電融合技術(shù)。 Li Meng和Don Wolf把這一技術(shù)應(yīng)用于靈長(zhǎng)類(lèi)于1997年發(fā)表了克隆恒河猴的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[17]。他們的工作為基因治療提供了有效的動(dòng)物模型。
3.2 以胚胎和初生動(dòng)物細(xì)胞系為基礎(chǔ)的核移植 應(yīng)用胚胎分裂球作為細(xì)胞核供體有許多限制。如何產(chǎn)生合適的胚胎細(xì)胞是個(gè)瓶頸，而且分離的分裂球難以在體外進(jìn)行遺傳操作，使得克隆之前無(wú)法有效地向其轉(zhuǎn)移基因。因此許多學(xué)者從事發(fā)展基于胚胎或初生動(dòng)物細(xì)胞系的核移植策略。 1996年位于蘇格蘭的Ian Wilmut研究小組報(bào)告他們利用細(xì)胞系獲得轉(zhuǎn)基因綿羊的結(jié)果[18]。用于核移植的細(xì)胞系來(lái)自于胚胎，已經(jīng)在體外培養(yǎng)了6-13代，在移植之前用血清饑餓法誘導(dǎo)其停止生長(zhǎng)。1997年利用轉(zhuǎn)染人IX因子基因的綿羊羊胎纖維母細(xì)胞獲得的核移植綿羊克隆獲得成功[19]。 Cibelli, Stice and Robl首次報(bào)告了使用永生化的胎牛纖維母細(xì)胞作為細(xì)胞核供體獲得的克隆轉(zhuǎn)基因奶牛。他們的工作首次證明活躍分裂的細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞核移植以后可以繼續(xù)發(fā)育[20]。
3.3 以分化成熟細(xì)胞為基礎(chǔ)的核移植 應(yīng)用細(xì)胞系的核移植研究為分化成熟細(xì)胞的克隆掃除了障礙。Ian Wilmut于1997年報(bào)告了第一只來(lái)自分化成熟細(xì)胞的動(dòng)物克隆---綿羊多利[21]，這一成果震動(dòng)了整個(gè)世界。為多利提供細(xì)胞核的是一只成年綿羊的乳腺上皮細(xì)胞，同樣應(yīng)用了血清饑餓誘導(dǎo)法處理細(xì)胞。 此后不斷有應(yīng)用體細(xì)胞作為細(xì)胞核供體獲得克隆動(dòng)物的報(bào)告[22-24]，證明了多利的技術(shù)路線確實(shí)是可行的。
4、電穿孔設(shè)備的性能 早期電穿孔設(shè)備的波形和時(shí)間都是固定的，使用不便且效果差。20年來(lái)的發(fā)展使得設(shè)備本身和附件的技術(shù)水平都有了很大提高。
4.1脈沖形狀早期的指數(shù)衰減式脈沖一直沿用至今，保留在低端產(chǎn)品的設(shè)計(jì)上，主要用于基因轉(zhuǎn)染。新開(kāi)發(fā)的方波脈沖產(chǎn)品成為目前市場(chǎng)上的主流，在眾多品牌中方波脈沖的純度和重現(xiàn)性并不完全一致，應(yīng)選擇那些專(zhuān)業(yè)廠家的產(chǎn)品。有的產(chǎn)品用一系列高頻脈沖代替方波，其導(dǎo)入基因和細(xì)胞融合的效率還有待于進(jìn)一步證實(shí)。除了直流脈沖以外，有些用于細(xì)胞融合的設(shè)備還可以產(chǎn)生非正弦交流波使細(xì)胞按電場(chǎng)方向排列，可比單純直流脈沖獲得更高的融合效率。
4.2 脈沖強(qiáng)度和時(shí)間 由于細(xì)菌和細(xì)胞的操作需要不同的脈沖強(qiáng)度和時(shí)間，而低端產(chǎn)品的強(qiáng)度和時(shí)間調(diào)整范圍都比較窄，因此作用單一。通用型產(chǎn)品可以產(chǎn)生0-3000V的電壓以及1微秒-10秒的脈沖，因此可應(yīng)用于細(xì)胞、細(xì)菌轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞融合、胚胎工程等多種操作。
4.3 外圍設(shè)備帶有監(jiān)視器、打印機(jī)和遙控器接口的細(xì)胞操作系統(tǒng)已經(jīng)出現(xiàn)，與這些設(shè)備配套使用能方便地記錄和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，可以在較短的時(shí)間內(nèi)取得較好結(jié)果。
